目的分析经直肠超声（TRUS）靶向穿刺联合游离前列腺特异抗原（f-PSA）/总前列腺特异抗原（t-PSA）诊断前列腺癌（PCa）及评估Gleason分级的价值。方法选取2020年8月至2022年10月该院收治的80例疑似PCa患者为研究对象，均接受TRUS靶向穿刺检查。以手术病理检查结果为“金标准”，统计TRUS靶向穿刺检查结果，比较PCa和非PCa患者临床资料、f-PSA/t-PSA，分析f-PSA/t-PSA单独及联合TRUS靶向穿刺诊断PCa的价值，比较不同Gleason分级PCa患者TRUS靶向穿刺阳性率、f-PSA/t-PSA。结果80例疑似PCa患者的手术病理检查结果显示48例患者确诊为PCa（均为腺癌），纳入PCa组；另外32例患者均确诊为良性前列腺增生（BPH），纳入非PCa组。TRUS靶向穿刺诊断PCa的灵敏度、特异度和准确度分别为79.17%、78.13%、78.75%。PCa组f-PSA/t-PSA低于非PCa组，差异有统计学意义（P＜0.05）。f-PSA/t-PSA单独诊断PCa的曲线下面积（AUC）为0.824，TRUS靶向穿刺、f-PSA/t-PSA联合诊断PCa的灵敏度、特异度、准确度分别为93.75%、81.25%、88.75%。Gleason≥4+3 PCa患者TRUS靶向穿刺阳性率高于Gleason≤3+4 PCa患者，f-PSA/t-PSA低于Gleason≤3+4 PCa患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论TRUS靶向穿刺联合f-PSA/t-PSA诊断PCa能提高诊断效能。